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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

兔外周血來源內(nèi)皮祖分離自外周血；外周血是除骨髓之外的血液，臨床上常用一些方法把骨髓中的造血干細胞釋放到血液中，再在從血液中提取分離得到造血干細胞，我們把這樣得到的干細胞稱為外周血干細胞，在二十一世紀初人類開始的生命方舟計劃中提出外周血這一新概念。內(nèi)皮祖細胞是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞（Angioblast），是一群具有游走特性，能進一步增殖分化的幼稚內(nèi)皮細胞，缺乏成熟內(nèi)皮細胞的特征性表型，不能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，其功能主要為參與了出生后缺血組織的血管發(fā)生和血管損傷后的修復。研究顯示，內(nèi)皮祖細胞在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，并為缺血性疾病的研究治療提供了新思路，EPCs生物學特性和治療作用的研究成為這一領(lǐng)域新的熱點。

方法簡介：

實驗室分離的兔外周血來源內(nèi)皮祖采用采集外周血、密度梯度離心、差速貼壁法結(jié)合內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔外周血來源內(nèi)皮祖經(jīng)CD34免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：內(nèi)皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代；不建議多次傳代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔外周血來源內(nèi)皮祖體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠醌NADH脫氫酶1(NQO1)檢測試劑盒 ，英文名： NQO1 ELISA Kit

Monkey collagenase I (Collagenase I) ELISA Kit膠原酶I(Collagenase I)檢測試劑盒

Ratulasensitivethyroid-stimulatinghormone,U-TSHELISAKit 大鼠高靈敏度促甲狀腺激素(U-TSH)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforFT4ELISAKit大鼠游離甲狀腺素

細胞琥珀酸脫氫酶活性染色試劑盒50次

RatpregnancyassociatedplasmaproteinA,PAPP-AELISAKit大鼠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

重組人 TrkC / NTRK3 蛋白 (His & Fc 標簽) Protein

性別決定區(qū)Y框蛋白18(SOX18)重組蛋白 Recombinant Sex Determining Region Y Box Protein 18 (SOX18)

GLT8D2重組人 GLT8D2 蛋白 Protein

IL10RB Protein Human 重組人 IL10Rb 蛋白

Spike Protein MERS-CoV 中東呼吸綜合征 MERS-CoV (HCoV-EMC/2012) Spike protein fragment (RBD, aa 367-606, His 標簽)

性別決定區(qū)Y框蛋白18(SOX18)重組蛋白 Recombinant Sex Determining Region Y Box Protein 18 (SOX18)

IL10RB Protein Human 重組人 IL10Rb 蛋白

NTRK3重組人 TrkC / NTRK3 蛋白 (His & Fc 標簽) Protein

Spike Protein MERS-CoV 中東呼吸綜合征 MERS-CoV (HCoV-EMC/2012) Spike protein fragment (RBD, aa 367-606, His 標簽)

GLT8D2重組人 GLT8D2 蛋白 Protein

豚鼠心肽(ANP)檢測試劑盒 ，英文名： ANP ELISA Kit

Human secretory immunoglobulin A (SIgA) ELISA Kit 人分泌型免疫球蛋白A(SIgA)檢測試劑盒

rabbitbasicfibroblastgrowthfactor,bFGFELISAKit 兔子堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforBCGF(HumanBcellgrowthprotein)ELISAKit人B細胞生長因子

凝結(jié)時間(FIB)Clauss法檢測試劑盒20次

RabbitCompleme3,C3ELISAKit兔補體蛋白3(C3)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

兔外周血來源內(nèi)皮祖細胞十六烷基-二甲基-乙基  50g

CetyldimethylethylAmmoniumBromide   100g

化十六烷基   100g

CetylpyridniumChloride,Monohydrate   500g