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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

兔大隱靜脈內皮分離自大隱靜脈；大隱靜脈起于足背靜脈弓內側端，經(jīng)內踝前方，沿小腿內側緣伴隱神經(jīng)上行，經(jīng)股骨內側髁后方，進入大腿內側部，與股內側皮神經(jīng)伴行，逐漸向前上，在恥骨結節(jié)外下方穿隱靜脈裂孔，匯入股靜脈，其匯入點稱為隱股點。有5條屬支：旋髂淺靜脈、腹壁淺靜脈、外靜脈、股內側淺靜脈和股外側淺靜脈，它們匯入大隱靜脈的形式多樣，相互間吻合豐富。大隱靜脈曲張行高位結扎時，須分別結扎、切斷各屬支，以防復發(fā)。大隱靜脈內皮細胞對維持大隱靜脈動態(tài)平衡起著重要作用。它們合成、分泌凝血和纖溶系統(tǒng)的激活因子和抑制因子、影響血小板粘附和聚集的調節(jié)因子；大隱靜脈內皮細胞還釋放控制細胞增殖和調節(jié)血管壁緊張度的分子。

方法簡介：

實驗室分離的兔大隱靜脈內皮采用-膠原酶聯(lián)合消化法結合差速貼壁法、并通過內皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔大隱靜脈內皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：內皮細胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔大隱靜脈內皮體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠N-甲基-D-天氡酸離子能谷酸受體1(GRIN1)檢測試劑盒 ，英文名： GRIN1 ELISA Kit

Malondialdehyde (MDA) ELISA Kit 人二(MDA)檢測試劑盒

ChickensecretoryimmunoglobulinA,SIgAELISAKit 雞分泌型免疫球蛋白A(SIgA)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforcANCA(humanai-neuophilcytoplasmicaibody)ELISAKit人抗中性粒細胞胞漿抗體

細菌β-半乳糖苷酶活性超敏熒光定量檢測試劑盒20次

Ratadiponectin,ADPELISAKit大鼠脂聯(lián)素(ADP)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

KIT重組大鼠 KIT / c-KIT 蛋白 (Fc 標簽) Protein

GAP-43 ( Growth associated protein-43 0.5mgGAP-43 ( Growth associated protein-43 ) 生長相關蛋白-43(抗原)

CD40LG重組人 CD40L / CD154 / TNFSF5 蛋白 (Fc 標簽) Protein

IL17A Protein Human 重組人 IL17 / IL17A 蛋白

SDC1 Protein Mouse 重組小鼠 Syndecan-1 / SDC1 / CD138 蛋白

GAP-43 ( Growth associated protein-43 0.5mgGAP-43 ( Growth associated protein-43 ) 生長相關蛋白-43(抗原)

IL17A Protein Human 重組人 IL17 / IL17A 蛋白

KIT重組大鼠 KIT / c-KIT 蛋白 (Fc 標簽) Protein

SDC1 Protein Mouse 重組小鼠 Syndecan-1 / SDC1 / CD138 蛋白

CD40LG重組人 CD40L / CD154 / TNFSF5 蛋白 (Fc 標簽) Protein

豚鼠內皮型合成酶(eNOS)檢測試劑盒 ，英文名： eNOS ELISA Kit

Human low density lipoprotein (LDL) ELISA Kit 人低密度脂蛋白(LDL)檢測試劑盒

Monkeyadrenomedullin,ADMELISAKit腎上腺髓質素(ADM)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforBigET(MouseBigEndothelin)ELISAKit小鼠大內皮素

細菌尿素酶(UREASE)活性比色法定量檢測試劑盒20次

Rabbitlipoproteinα,Lp-αELSIAKit兔脂蛋白α(Lp-α)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

兔大隱靜脈內皮細胞山羊壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

山羊胰島素樣生長因子1（IGF-1）檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

山羊血小板衍化生長因子（PDGF）檢測試劑盒         組裝/原裝

山羊生長激素釋放多肽(GHRP)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝