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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

大鼠腦微血管內(nèi)皮分離自腦組織；腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的主要組成成分，它是組成腦微血管腔面單層扁平上皮樣細胞，能夠限制可溶性物質(zhì)和細胞等從血液進入大腦，大腦微血管內(nèi)皮細胞與外周內(nèi)皮細胞相比具有一些相同特性。它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等有重要作用，在腦血管疾病的發(fā)病機制中有重要病理生理學意義。與外周內(nèi)皮細胞相同，大腦微血管內(nèi)皮細胞表面表達細胞粘附分子，調(diào)控白細胞進入大腦。由于微血管內(nèi)皮細胞的器官特異性，內(nèi)皮細胞通常取源于疾病研究的相關組織。其主要特征如下：①腦微血管內(nèi)皮細胞存在許多細胞間緊密連接，產(chǎn)生很高的跨內(nèi)皮阻抗，延遲細胞旁的通量；②腦微血管內(nèi)皮細胞缺乏內(nèi)皮細胞的窗孔結構，其液相物質(zhì)胞飲水平較低；③腦微血管內(nèi)皮細胞具有不對稱定位酶和載體介導轉運系統(tǒng)，從而產(chǎn)生“兩極分化"的表現(xiàn)型。

方法簡介：

公司實驗室分離的大鼠腦微血管內(nèi)皮采用膠原酶-混合消化法結合密度梯度離心法、后通過內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的大鼠腦微血管內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 內(nèi)皮細胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

人脂0壁酸試劑盒   人脂0壁酸試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   人脂0壁酸試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：試劑盒（進口分裝），產(chǎn)品別名：人脂0壁酸試劑盒、人脂0壁酸試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

人脂聯(lián)素試劑盒   人脂聯(lián)素試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   人脂聯(lián)素試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：試劑盒（進口分裝），產(chǎn)品別名：人脂聯(lián)素試劑盒、人脂聯(lián)素試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

人脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白試劑盒   人脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   人脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：試劑盒（進口分裝），產(chǎn)品別名：人脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白試劑盒、人脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

人脂肪酸結合蛋白試劑盒   人脂肪酸結合蛋白試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   人脂肪酸結合蛋白試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：試劑盒（進口分裝），產(chǎn)品別名：人脂肪酸結合蛋白試劑盒、人脂肪酸結合蛋白試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

豚鼠腸脂肪酸結合蛋白(iFABP)試劑盒 ，英文名： iFABP ELISA Kit

Human multidrug resistance associated protein (MRP) ELISA Kit 人多藥耐藥相關蛋白(MRP)試劑盒

rabbitsolubleP-selectin,sP-selectinELISAKit 兔子可溶性P選擇素(sP-selectin)試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforBetaGD(HumanBeta-glucuronidase)ELISAKit人β葡萄糖酸苷酶

細菌腺苷酸激酶(Adenylatekinase)活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量試劑盒20次

rabbithepatocytegrowthfactor,HGFELISAKit兔子肝細胞生長因子(HGF)試劑盒規(guī)格：96T/48T

SCGB1A1重組小鼠 Uteroglobin / SCGB1A1 蛋白 Protein

Enah/Vasp樣蛋白(EVL)重組蛋白 Recombinant Enah/Vasp Like Protein (EVL)

MAG重組人 MAG / GMA / Siglec-4 蛋白 (Fc 標簽) Protein

IL5RA Protein Human 重組人 IL5Ra / CD125 蛋白

GFRA1 Protein Rat 重組大鼠 GFRA1 / GFR alpha-1 蛋白

Enah/Vasp樣蛋白(EVL)重組蛋白 Recombinant Enah/Vasp Like Protein (EVL)

IL5RA Protein Human 重組人 IL5Ra / CD125 蛋白

SCGB1A1重組小鼠 Uteroglobin / SCGB1A1 蛋白 Protein

GFRA1 Protein Rat 重組大鼠 GFRA1 / GFR alpha-1 蛋白

MAG重組人 MAG / GMA / Siglec-4 蛋白 (Fc 標簽) Protein

大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞豚鼠白介素1β(IL1B)試劑盒 ，英文名： IL1B ELISA Kit

Human ubiquitin conjugating enzyme (E2/UBCE) ELISA Kit 人泛素結合酶(E2/UBCE)試劑盒

rabbitIerleukin6,IL-6ELISAKit 兔子白介素6(IL-6)試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforBeta-CG(HumanChorionicGonadoophinBeta)ELISAKit人絨毛膜β

細菌乙醇脫氫酶總活性(NDMA)比色法定量試劑盒20次

rabbitfollicle-stimulatinghormone,FSHELISAKit兔子促卵泡素(FSH)試劑盒規(guī)格：96T/48T